08/07/2017 ИМКБ СО РАН

Померимся хромосомами? Ученые ИМКБ СО РАН о результатах исследований и о гипотезах

45 ИМКБ СО РАН СО РАН РНФ Науки о жизни Новосибирск Интервью Учёные Института молекулярной и клеточной биологии СО РАН обнаружили, что разница в длине хромосом, на которую никто не обращает внимания из-за большой вариативности нормы, значительно заметнее у пациентов с диагнозом «интеллектуальная недостаточность». О результатах исследования на сегодняшний день и о гипотезах корреспонденту Сиб.фм рассказали сотрудники сектора хромосомных патологий ИМКБ СО РАН.

800 генов умственной отсталости

Заведующий сектором хромосомных патологий Дмитрий Юдкин третий год руководит группой учёных, которая проводит комплексные исследования механизмов развития синдрома ломкой Х-хромосомы в рамках гранта от Российского научного фонда (РНФ). Этот синдром — самая распространённая причина наследственной умственной отсталости, но не основная.

— В ДНК есть ген FMR1, который отвечает за развитие головного мозга на эмбриональных этапах. В самом начале этого гена находится участок ДНК, повторяющийся несколько раз: в норме он не должен превышать 50 повторов, но происходят какие-то изменения, механизмы которых сейчас исследуют, и этот участок увеличивается до 200 и более повторов. При этом ген FMR1 прекращает свою работу, нарушается развитие головного мозга и развивается синдром. Хромосома становится ломкой от того, что система репликации не может удвоить увеличенный повтор. Когда ген «выключается», он перестаёт синтезировать необходимый белок, — пояснил Дмитрий Юдкин.

 

 По его словам, примерно треть пациентов — с синдромом ломкой Х-хромосомы, а две трети — это какие-нибудь другие причины. Чаще всего они не известны на генетическом уровне. Тогда говорят о том, что у пациентов недифференцированная умственная отсталость, то есть причина у неё не определена.

Сейчас уже найдено более 800 генов, которые отвечают за развитие умственной отсталости — и это далеко не все.

Большинство из обнаруженных случаев умственной отсталости — единичные или их буквально несколько штук в мире.

В конце мая в Копенгагене была конференция Европейского общества генетики человека, где обсуждали заболевания, которые находятся на практике, но нигде в литературе не описаны. Сейчас есть база данных, в которую можно внести найденные генетические изменения и посмотреть, вводил ли их кто-нибудь ещё по всему миру.

 

 — Например, находится по всему миру пять таких случаев, при этом они идеально совпадают по симптомам, идёт одна и та же мутация. По сути происходит описание нового заболевания — умственная отсталость с определённой природой, которая развивается по своим причинам.

Пациентов с аутизмом либо умственной отсталостью в институт направляет Новосибирский областной клинический диагностический центр, который входит в структуру горбольницы. Кроме того, сейчас налаживается сотрудничество с Новосибирским областным детским психоневрологическим диспансером.

Когда находятся интересные случаи, учёные всегда звонят врачам и просят пригласить родителей.

Берут у них кровь, чтобы определить: это от родителей передалось или только у ребёнка.

 

Аномалия хромосом как интересный случай

Как раз недавно в выборке пациентов учёные заметили интересный случай. При диагностике одного ребёнка обратили внимание на то, что у одной из хромосом есть аномалия, и решили посмотреть, что это вообще за хромосома. Выяснилось, что она несёт гены рибосомной РНК и что у неё есть значительный протяжённый участок. Сейчас этой работой активно занимается Ирина Колесникова, которая год назад в рамках гранта приехала работать в Новосибирск из Санкт-Петербурга.

 

 — Этот случай интересен вот чем. У ребёнка с интеллектуальной недостаточностью было увеличено p-плечо (13-я хромосома человека) с амплификацией (процессом образования дополнительных копий участков хромосомной ДНК) генов рибосомой РНК. То есть значительно больше, чем бывает в норме. Хотя в норме их тоже может быть разное количество. Верхняя и нижняя граница в четыре раза различаются.

То есть существует вариабельность не только между людьми, но и в пределах организма в тканях, в разных клетках.

В случае когда невозможно определить степень умственной отсталости (например, из-за глухонемоты, слепоты), используется категория F78 «другие формы умственной отсталости»

Родители оказались контактными — оба сдали кровь. Учёные выяснили, откуда эта хромосома пришла: точно такая же обнаружилась у папы, у которого при этом не было умственной отсталости.

— В литературе такие случаи тоже были описаны — в 70-х годах. Я не совсем поняла, почему нет более поздних сообщений, может, цитогенетика стала не настолько популярна, — предполагает Ирина.

Сбой в работе клеточных станций

Когда учёные стали анализировать, что же может быть у пациентов с недифференцированной умственной отсталостью, заметили, что у некоторых из них пара хромосом гетероморфные. В нашем организме все хромосомы представлены парами, в каждой из которых две одинаковые хромосомы. Но есть ряд маленьких хромосом, у которых немного отличается длина. Эта длина как раз затрагивает тот район, где находятся гены рибосомной РНК. Рибосомы — это такие клеточные станции по производству белка. А белок — это по сути всё в нашем организме: и строительный материал, и ферменты.

 

 — Мы все состоим из белков, они — основа всей жизни. Часть этих рибосом закодирована как раз в этих разных хромосомах. Поэтому изменение длины хромосомы затрагивает информацию о рибосоме. Мы решили посмотреть, как это связано с умственной отсталостью.

Хотя сейчас «умственная отсталость» говорить не принято, ввели новый термин — «интеллектуальная недостаточность», — продолжает Ирина.

Примерно у двух из пяти человек встречаются такие хромосомы. Поскольку предполагается, что такие хромосомы могут быть связаны с умственной отсталостью, специалисты решили посмотреть, как коррелируются наличие такой хромосомы с патологией. Кроме того, им интересно, что нарушается, если такие хромосомы есть и у людей без умственной отсталости.

 

 — Это просто та вещь, на которую никто не обращает внимания. Разница в длине хромосом всегда считается нормой. У многих людей она есть, но мы обратили внимание на то, что у пациентов, которым ставят интеллектуальную недостаточность, она чаще встречается, причём значительно виднее.

То есть может быть и такое: количество генов изменилось, а их работа не нарушилась.

Тогда вопрос: как нарушается работа этих генов при интеллектуальной недостаточности? — комментирует исследователь.

Любой ген даёт свой продукт, кодирует информацию о чём-либо — о РНК или о белке. Рибосомные гены кодируют информацию о рибосомной РНК. Клеточные механизмы эту информацию прочитывают и делают рибосомную РНК. У всех людей для нормального функционирования клетки количество рибосом должно быть примерно на одном и том же уровне. А если нарушается работа какого-то гена, продукт становится либо меньше, либо больше — это неправильно. Как отмечают генетики, такого быть не должно.

 

 

Увеличение копий

По-видимому, само увеличение копий этого гена не является критичным, критичным является нарушение его работы. Может, по словам специалистов, это и объясняет причину такого высокого процента интеллектуальной недостаточности в современном мире.

— Когда мы посмотрели количество рибосомной РНК у исследуемой семьи, выяснили, что у мамы с папой количество рибосомных РНК не отличается от абсолютно здорового контроля, а у сына эти показатели повышены в пять-шесть раз. Мы обнаружили, что увеличение плеча произошло за счёт увеличения количества копий этих генов рибосомной РНК.

 

  

То есть они увидели, что отец является носителем увеличенной хромосомы, но у него до сих пор всё работает нормально. Он передал эту хромосому сыну, у того произошли какие-то сбои настроек. Если хромосома увеличивается, то организм пытается это компенсировать и выровнять уровень работы генов.

— У сына клетка с этим не справилась, поэтому началась работа увеличенного числа копий этого гена. Видимо, именно это как раз связано с интеллектуальной недостаточностью. После мы решили, что нужно посмотреть других недеференцированных пациентов на предмет гетероморфизма хромосом. Поняли, что их очень много, и начали смотреть уровень рибосомных РНК. Теперь мы знаем, что у пациентов с интеллектуальной недостаточностью повышается количество рибосомной РНК, — добавляет Ирина.

Генетики отметили, что у пациентов наблюдается ещё и сдвиг в балансе двух рибосомных РНК, которые являются показателями качества образца РНК. Это соотношение должно быть один к одному по количеству и два к одному по интенсивности. В выборке отмечен дисбаланс соотношений этих РНК.

Получается, что происходит нарушение не только на уровне синтеза предшественника РНК, но ещё и на уровне созревания этих рибосомных РНК.

Поиск количественных данных

Подобные сдвиги наблюдаются при нейродегенеративных заболеваниях, в частности при Альцгеймере. Но там сдвиг в другую сторону — в противоположную. Таким образом, сейчас нужно получить количественные данные о количестве копий генов.

— Альцгеймер лучше изучен: его пытаются как-то предотвратить, уменьшить проявления. Особенно много зарубежных исследований. Да и с умственной отсталостью за рубежом ситуация другая: например, на Западе на человека с таким диагнозом за всю его жизнь государство тратит примерно миллион долларов, — сообщает Ирина.

 Проблема, с которой в своих исследованиях столкнулись учёные на данном этапе, — это поиск метода, который позволит посчитать, на сколько штук увеличилось количество генов.

Именно в цифрах. В случае других генов это легко, а в данном — сложно.

— Сложно, потому что их копийность очень большая: если мы берём обычный ген, например пепсина (фермент, который помогает расщеплять белки в желудке), он у нас в организме существует всего в одной копии. Мы эту копию легко можем разными методами посчитать и увидеть: одна копия или их стало больше, потому что произошло какое-то нарушение. А гены рибосомной РНК даже в норме варьируются от 50 до 400 — разброс в восемь раз. И если обычного гена всего две штуки, то есть две копии, то в данном случае таких кластеров, где их по несколько штук, 10. 10 кластеров хромосом: если даже в одном произошли изменения в 50 или 100 раз, то в пределах всей клетки мы этого не увидим, потому что всё будет в пределах нормальных колебаний, — разъясняет Ирина.

 Они работали с одним методом — не получилось, сейчас пытаются другим. То есть пробуют стандартные методы по порядку.

— Мы очень надеемся, что найдём метод, который позволит сделать количественную оценку. Тот, который мы применяли на семье, предполагает только качественную. Причём когда нет сомнений об увеличении плеча на большом, протяжённом участке.

Но увеличение плеча может быть и совсем небольшим — в таких случаях необходима количественная оценка, чтобы адекватно сравнивать результаты.

Это не просто клинический случай, поэтому нам нужна статистика: любое заявление должно быть ею подкреплено, — поясняет генетик.

Это начало большой работы, которую ещё никто нигде не делал. Сейчас генетики будут набирать выборку и будут смотреть, почему же происходит развитие умственной отсталости.

— Даже в описанных в литературе случаях с увеличением коротких плечей только в двух или трёх статьях встречается оценка количества рибосомной ДНК. А уровень экспрессии рибосомной РНК вообще до нас никто не исследовал именно в связи с врождённой умственной отсталостью.

Все искали что-то другое, на это никто не обращал внимания, — подчёркивает учёный.

Для оценки уровня интеллекта детей с задержкой умственного развития обычно используются шкала интеллекта Станфорд — Бине и тест Векслера

Возможные причины возникновения умственной отсталости

Пока гипотеза этой группы учёных такова: всё дело в нарушении передачи сигналов между нервными клетками. Одна клетка имеет кучу отростков — дендритов и аксонов. Дендриты, короткие отростки, принимают сигнал, длинные аксоны передают его дальше. Аксон одной нервной клетки соединяется с дендритом другой и передаёт ей сигнал. Так сигнал передаётся от всех наших органов к мозгу и внутри него. Так вот передача сигнала по длинному-длинному аксону — это целая серия белковых реакций.

 

 — То есть для передачи сигнала нужно много белка. Если нарушилась сборка рибосом, — как раз то, что мы видим, — то будет нарушена передача сигнала. Возможно, всё связано с этим.

Рибосомный аппарат из-за плохого синтезирования белка не успевает быстро передать сигнал — это же доли секунды.

Ещё нашу семью посмотрели томографисты: у ребёнка видно, что в лобных долях нарушены проводящие пучки. Если в норме пучок должен идти вперёд и вниз, то у него вперёд и вверх, а потом разлетается в разные стороны, — комментирует Ирина.

Клеточная линия для исследований

Работа с белками сложнее, чем работа с РНК, как отмечают генетики. Поэтому, чтобы получать белок стабильного качества, нужна стабильная структура клеток. Из клеток они будут выделять рибосомные белки и смотреть соотношения с рибосомной РНК.

— Интересно будет в дальнейшем получить культуры нервных клеток и исследовать передачу сигнала у людей с нормальным уровнем рибосомной РНК и у людей с повышенным уровнем. И мы увидим, нарушается передача сигнала или нет. По крайней мере, есть работы, которые показывают нарушение синтеза рибосом — они сделаны на материале мышей. Мы движемся в интересном направлении, — отмечает Ирина.

 

 Существует проблема выбора модели: так как на человеке нельзя исследовать, нужно выбрать модель, близкую к естественным условиям. В случае человека это чаще всего клеточная линия.

— На человеке, в том числе из-за вопросов этики, можно работать только на культурах. Как правило, это клетки, которые можно замораживать, потом размораживать и опять работать. Много известных клеточных линий изначально онкогенные, поэтому сразу встаёт вопрос экстраполяции результатов. К тому же в случае рибосомных генов показано, что в активно делящихся клетках уровень рибосомной РНК увеличивается, а уж в онкологии это происходит постоянно.

Получается, что единственная более или менее адекватная модель для исследования на человеке — это работа со стволовыми клетками.

Методы современной биологии позволяют взять кровь у пациента и из неё уже выращивать нервные клетки. Генетики могут ввести в эти клетки плазмиды с нужным количеством копий генов рибосомной РНК и смотреть, как они работают, как влияют на развитие самих клеток и их взаимодействие в культуре. Для этого берётся кровь, её клетки — специализированы: они имеют определённую форму и вырабатывают определённые белки для выполнения строго своей функции.

 

 — У нас в организме есть и недифференцированные клетки — стволовые — без каких-либо признаков и функций. Их задача — превратиться в клетку в нужной части организма, в которой она будет нужна здесь и сейчас. В организме всегда есть стволовые клетки, которые приходят туда, где нужны какие-то клетки, и превращаются в них. Сейчас есть методы, которые позволяют взять клетку из любой ткани организма и превратить её обратно в стволовую. То есть клетка может обратно превратиться в недифференцированную. Затем с помощью специальных реактивов её можно стимулировать и превратить в любую ткань, которая нужна, — рассказывает Ирина.

Эти нервные клетки, когда появляются в культуре, начинают друг с другом собираться и формировать структуры.

Их называют нейросферы — это не мозг, но система нервных клеток, которые друг с другом взаимодействуют и передают сигнал.

Именно они помогают работать с наиболее приближенной моделью.

И главное, на что должны выйти исследователи, — это механизмы, из-за которых происходит нарушение.

— Мы будем получать стволовые клетки и смотреть, что происходит в нейронах. К тому же интересно, что происходит с самой рибосомой, когда нарушается её сборка. Рибосома состоит из рибосомной РНК и белка. Мы увидим, что рибосомной РНК стало в семь раз больше, но белок, скорее всего, остался на том же уровне, поэтому сам процесс сборки рибосомы будет нарушен. То есть получится: либо не функциональная рибосома, либо что-то ещё. Кроме того, нам нужно посмотреть рибосомные белки. Есть опубликованные работы, в которых указано, что нарушения синтеза некоторых из них часто сопровождаются снижением IQ.

 В данном случае речь идёт не о тяжёлой умственной отсталости, а о лёгкой. В выписках не указывается уровень IQ, только диагноз: «Задержка умственного развития лёгкой степени». Многие пациенты — это маленькие дети, поэтому не известно, как всё будет прогрессировать. Пока же учёные ищут ответы на все эти вопросы. И делают то, чего ещё никто из их коллег не делал.

Мария Тищенко